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種植體骨磨片組織學(xué)效果對(duì)比論文
目前，對(duì)種植體周圍骨愈合和骨結(jié)合的研究方法主要采用骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析方法。而種植體與其周圍骨組織的結(jié)合狀態(tài)、成骨效果以及骨細(xì)胞學(xué)研究可通過組織學(xué)方法觀察、研究和分析。不脫鈣種植體骨磨片能完整顯示種植體與骨結(jié)合的界面和礦化結(jié)構(gòu)，不同磨片染色后，骨組織細(xì)微結(jié)構(gòu)顯示不同。本實(shí)驗(yàn)通過3種不同特殊染色方法進(jìn)行種植體骨磨片染色，對(duì)組織顯示效果進(jìn)行比較分析，探討種植體骨組織形態(tài)學(xué)的研究方法，為種植體骨形態(tài)計(jì)量參數(shù)的研究提供依據(jù)。
1材料和方法
1．1種植體骨組織取材與預(yù)處理
在Beagle犬脛骨植入12枚BLB純鈦圓柱狀種植體(北京萊頓生物材料有限公司)，8周后處死動(dòng)物，制取種植體骨組織標(biāo)本，將其固定于甲醛溶液48h，酒精逐級(jí)脫水，氯仿透明，甲基丙烯酸甲酯與鄰苯二甲酸二丁酯混合液浸潤(rùn)、包埋［1］。
1．2種植體骨磨片的制作
將修整好的包埋塊固定于EXAKT300CP切片機(jī)(Leica公司，德國)切取200～300μm厚的切片，然后用EXAKT400CS磨片機(jī)(Leica公司，德國)，分別以粒徑18μm(800目)、11．5μm(1200目)、5．2μm(2500目)水砂紙將切片磨至10～15μm厚，最后以粒徑3．2μm(4000目)水砂紙拋光切片組織表面至完全無磨痕。每個(gè)標(biāo)本制作3張磨片，分別采用3種不同染色方法進(jìn)行染色。
1．3配制染色液
1．3．1亞甲基藍(lán)－酸性品紅染色液［2］亞甲基藍(lán)染液包括溶液A和溶液B。溶液A:亞甲基藍(lán)1g，蒸餾水75mL;溶液B:高錳酸鉀1．5g，蒸餾水75mL。將溶液A、B混合，100℃水浴至沉淀溶解后冷卻至室溫過濾�？辔端崴嵝云芳t染液:冰醋酸0．5mL，酸性品紅0．25g，甘油10mL，蒸餾水90mL，加苦味酸至飽和。
1．3．2Goldner’s三色染色液［3］①Weigert’s鐵蘇木素液由溶液A和溶液B混合而成。溶液A:1g蘇木素溶于100mL95%乙醇溶液;溶液B:1．16g三氯化鐵、100mL蒸餾水、1mL鹽酸混合。②麗春紅－酸性品紅液:0．4g麗春紅、0．1g酸性品紅、0．6mL冰醋酸與300mL蒸餾水混合。③磷鎢酸－橙黃G液:15g磷鎢酸與300mL蒸餾水混合后，加入6g橙黃G混勻。④亮綠液:0．9g亮綠、0．6mL冰醋酸、300mL蒸餾水混合。
1．3．3甲苯胺藍(lán)染色液①檸檬酸(枸椽酸)磷酸緩沖液由溶液A、B混合而成。溶液A:0．1mol/L檸檬酸溶液，由檸檬酸20．01g加蒸餾水至1000mL配制而成;溶液B:0．2mol/L磷酸氫二鈉溶液，由十二水磷酸氫二鈉71．6g加蒸餾水至100mL配制而成;取溶液A32．3mL、溶液B17．7mL，混合即成pH值為3．8的緩沖液。②甲苯胺藍(lán)液:甲苯胺藍(lán)2．0g溶于100mL緩沖液，溶解后過濾，用1mol/LNaOH調(diào)pH值至3．8。
1．4磨片染色
1．4．1亞甲基藍(lán)－酸性品紅染色法［4］將磨片置于亞甲基藍(lán)染液染色，60℃水浴15min，濾紙吸干染液;60℃蒸溜水漂洗，干燥;酸性品紅染液染色5min，濾紙吸干染液;95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片。
1．4．2Goldner’s三色法［4］將磨片脫塑至水，Weigert’s鐵蘇木素液15min，蒸溜水漂洗1次，流水沖洗15min，蒸餾水漂洗1次，麗春紅－酸性品紅液15min，1%醋酸液漂洗2次，磷鎢酸－桔黃G液8min，1%醋酸液漂洗2次，亮綠液15min，1%醋酸液漂洗2次，70%乙醇漂洗1次，100%乙醇漂洗2次，二甲苯透明，樹脂封片。
1．4．3甲苯胺藍(lán)染色法將磨片脫塑至水，甲苯胺藍(lán)染色液10min，檸檬酸(枸椽酸)磷酸緩沖液沖洗2次，1min/次，吸干磨片水分，乙醇脫水2次，1min/次，二甲苯透明2次，1min/次，樹脂封片。
1．5組織學(xué)觀察
將3種特殊染色法染色后的磨片置于倒置相差顯微鏡下，觀察并采集圖像。
2結(jié)果
2．1亞甲基藍(lán)－酸性品紅染色法
亞甲基藍(lán)－酸性品紅染色后種植體骨結(jié)合界面清晰，種植體表面羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)涂層為紫紅色，成骨細(xì)胞及細(xì)胞核、類骨質(zhì)顯示清晰，成骨細(xì)胞核染成深藍(lán)色，細(xì)胞基質(zhì)染成淡藍(lán)色，類骨質(zhì)為紫灰色。新骨組織為深紅色，與種植體骨界面分界清晰，原礦化骨組織為紅色，與新生骨分界較模糊(圖1A)。
2．2Goldner’s三色法
Goldner’s三色法染色后種植體骨結(jié)合界面清晰，種植體表面HA涂層為亮綠色，新生骨為深綠色，原礦化骨為綠色，二者界限清楚，成骨細(xì)胞為橘黃色，著色淺，不能分辨細(xì)胞核及其基質(zhì)，類骨質(zhì)染成橘紅色，成骨細(xì)胞與類骨質(zhì)分界模糊(圖1B)。
2．3甲苯胺藍(lán)染色法
甲苯胺藍(lán)染色顯示種植體骨結(jié)合界面較模糊，種植體表面HA涂層為藍(lán)紫色，新生骨為深藍(lán)色，原礦化骨為淡紫色，二者界限清楚;類骨質(zhì)為淺藍(lán)色，鈣化前緣為絳紫色顆粒，成骨細(xì)胞呈深藍(lán)色，與新生骨分界模糊，類骨質(zhì)與新生骨界限不清(圖1C)。
3討論
骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)是一門體視學(xué)技術(shù)，能直觀定量觀察和研究骨組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)。對(duì)未脫鈣骨種植體磨片的骨組織形態(tài)學(xué)分析能直觀顯示種植體與骨組織間的細(xì)微結(jié)構(gòu)、結(jié)合狀態(tài)及成骨效果等，經(jīng)不同染色方法可以觀察到骨組織及種植體骨界面的不同細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)。組織學(xué)染色方法可大體分為常規(guī)染色法(如HE染色)及特殊染色法，后者包括Masson染色法、甲苯胺藍(lán)－酸性品紅染色法［5－6］、Goldner’s三色法、銀染色法、抗酸染色法等。不同染色法可獲得不同參數(shù)信息，不同研究目的可選擇不同染色法，對(duì)種植體骨磨片采用合適的染色法可以更清晰顯示骨成熟狀態(tài)和骨組織各種分化狀態(tài)。黃鵬等［7］研究發(fā)現(xiàn)Masson染色硬組織切片，染色整體效果不佳。本實(shí)驗(yàn)采用3種特殊染色方法對(duì)種植體骨磨片染色，Goldner’s三色法和甲苯胺藍(lán)染色法染色后，新生骨與原礦化骨間界限清晰，可較準(zhǔn)確地測(cè)量新生骨面積。朱震坤等［8］采用甲苯胺藍(lán)染色法研究種植體骨結(jié)合界面新生骨與礦化骨也取得較好效果。本研究顯示種植體骨結(jié)合界面采用亞甲基藍(lán)－酸性品紅染色法和Goldner’s三色法染色更清晰，故在研究種植體骨結(jié)合面積時(shí)較精確。亞甲基藍(lán)－酸性品紅染色法能清楚顯示成骨細(xì)胞、細(xì)胞基質(zhì)及類骨質(zhì)，對(duì)骨形成靜態(tài)參數(shù)如成骨細(xì)胞指數(shù)、類骨質(zhì)均寬、類骨質(zhì)表面、類骨質(zhì)體積的研究效果理想。Goldner’s三色法在研究骨結(jié)構(gòu)參數(shù)如礦化骨均寬、礦化骨體積方面占優(yōu)勢(shì)。王東勝等［1］研究表明亞甲基藍(lán)－堿性品紅染色能更好辨析骨細(xì)胞狀態(tài)，與甲苯胺藍(lán)染色相結(jié)合，更好地反映骨的礦化狀態(tài)。本研究也顯示聯(lián)合應(yīng)用染色方法可更好獲得骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)信息。
綜上所述，在種植體骨組織改建研究方面，Gold-ner’s三色法及甲苯胺藍(lán)染色法有優(yōu)勢(shì)，利于觀察新礦化骨與原板層骨，利于骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的測(cè)量。而在種植體骨結(jié)合界面的細(xì)胞學(xué)研究方面，骨磨片染色宜采用亞甲基藍(lán)－酸性品紅染色法。如需對(duì)種植體骨結(jié)合界面進(jìn)行全面研究，則須行2種或以上的染色方法以彌補(bǔ)染色顯示的不足，獲得全面的骨結(jié)合與骨愈合及骨改建成熟的參數(shù)。本研究?jī)H對(duì)HA涂層種植體骨磨片染色進(jìn)行比較，其他表面種植體骨界面染色效果需進(jìn)一步研究。
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