- 蛋白提取實(shí)驗(yàn)步驟 推薦度:
- 相關(guān)推薦
蛋白提取實(shí)驗(yàn)步驟
蛋白提取實(shí)驗(yàn)步驟:
1、細(xì)胞總蛋白提取
A、對于懸浮細(xì)胞: 離心收集細(xì)胞,每106細(xì)胞加250 ul RIPA(在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑),振蕩。如果需要提高蛋白濃度,可以適當(dāng)減少細(xì)胞總蛋白提取試劑體積。
B、對于貼壁細(xì)胞:
a、用TBS沖洗細(xì)胞2-3次。最后一次http://m.dameics.com徹底吸干殘留液。
b、加入適當(dāng)體積的 RIPA(使用前數(shù)分內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)于培養(yǎng)板、瓶內(nèi)3-5分鐘。期間反復(fù)晃動培養(yǎng)板、瓶,使試劑與細(xì)胞充分接觸。
c、用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下,收集到1.5ml離心管中。
C、冰浴30min,期間用移液器反復(fù)吹打,確保細(xì)胞完全裂解。
D、12000g離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。
2、組織蛋白提。
A、組織塊用冷TBS洗滌2-3次,去除血污,剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)冰上徹底勻漿。如果需要提高蛋白濃度,可以適量減少該試劑體積。
B、將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中,振蕩。冰浴30min,期間用移液器反復(fù)吹打,確保細(xì)胞完全裂解。
C、12000g離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。
注意事項(xiàng)
1、組織盡可能新鮮,若不能及時(shí)提蛋白,組織標(biāo)本應(yīng)保存在-80℃冰箱,并避免反復(fù)凍融。
2、全程必須在冰上進(jìn)行,避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制劑在水溶液中不穩(wěn)定,需在RIPA使用前數(shù)分鐘加入蛋白酶抑制劑。
4、裂解過程中如有溶液粘稠現(xiàn)象可用移液器(200μl)反復(fù)吹打,或再加入適量裂解液以保證充分裂解。
5、總蛋白溶液不穩(wěn)定(蛋白酶依舊有活性)可在-80℃短時(shí)間保存,建議立即加入蛋白上樣緩沖液變性后與-20℃保存,避免反復(fù)凍融。
【蛋白提取實(shí)驗(yàn)步驟】相關(guān)文章:
蛋白提取實(shí)驗(yàn)步驟03-21
苜蓿葉蛋白的提取方法及展望04-27
麻瘋樹Curcin蛋白提取純化條件的優(yōu)化及抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)05-02
豬皮膠原蛋白的提取及其結(jié)構(gòu)表征04-26
UASB處理蛋白廢水的實(shí)驗(yàn)研究04-26
白鯽魚C-反應(yīng)蛋白提取條件的優(yōu)化04-25
DNA的提取與鑒定實(shí)驗(yàn)報(bào)告09-06
DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)05-03
沙苑子粗多糖的提取和脫蛋白方法的比較研究05-02