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TCB4-1細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)+-2-
第四章
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
1
Outline
1.
2.
3.
4.Animal cell cultureHuman cell cultureStem cell cultureTumor cell culture
2
Deng XB, et al., Apoptosis. 201143
Animal cell culture
?Primary culture
Sensitive
Complex
?Cell line
ATCC (American Type Culture Collection)
4
動(dòng)物原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
?動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)
是從動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)
胞或者組織，模擬體
內(nèi)的生理環(huán)境，在無(wú)
菌、適溫和豐富的營(yíng)
養(yǎng)條件下，使離體細(xì)
胞或者組織生存、生
長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能
的一門技術(shù)。
5
6
每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程?游離期
?貼壁期
?潛伏期
?對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期
?停止期（平臺(tái)期）
7
8
游離期：
細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。
9
10
貼壁期：
?細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10 min－4 h貼壁。
底物：膠原、玻璃、塑料、其他細(xì)胞等。?血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。?進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的
11功能基團(tuán)）。
12
潛伏期：
此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)話動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：
細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
停止期（平臺(tái)期）：
細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性。13
倒置顯微鏡
?一般觀察：
?培養(yǎng)液顏色（CO2、pH指示劑）桃紅色－正常；橙黃色－較好；
淡黃色－時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)不足、細(xì)胞死亡紫紅色－死亡
?細(xì)胞透明度
顆粒物、空泡、胞膜
14
15
圖受精卵的全能性
16
圖植物細(xì)胞的全能性
17
What is the stem cell？
細(xì)胞在分化過(guò)程中往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最終衰老死亡。機(jī)體在發(fā)展適應(yīng)過(guò)程中為了彌補(bǔ)這一不足，保留了一部分未分化的原始細(xì)胞，稱之為干細(xì)胞。一旦需要，這些干細(xì)胞可按照發(fā)育途徑通過(guò)分裂而產(chǎn)生分化細(xì)胞。
18
?Tree of Embryon
Development
Mesoderm: 中胚層Endoderm: 內(nèi)胚層Ectoderm: 外胚層Implantation: 植入U(xiǎn)terus: 子宮19
20
Totipotent cells: 全能細(xì)胞
Pluripotent stem cells:
多能干細(xì)胞
圖干細(xì)胞的分化潛能
21
分類
?按分化能力的大小，干細(xì)胞可以分為：
?全能干細(xì)胞，它具有形成完整個(gè)體的分化潛能。胚胎干細(xì)胞就屬于此類，它具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和很強(qiáng)的分化能力，可以無(wú)限增殖并分化成為全身200多種細(xì)胞類型，從而可以進(jìn)一步形成人體的任何組織或器官。
22
?專門型干細(xì)胞，只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化。利用專門型干細(xì)胞培育人體細(xì)胞和組織的研究已經(jīng)取得了一定成果，但利用前景更廣闊的，還是分化能力最強(qiáng)的全能干細(xì)胞。如果能源源不斷地獲得這種全能干細(xì)胞，就可以在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的組織細(xì)胞甚至器官供移植。
23
胚胎干細(xì)胞生物學(xué)特征：
?具有早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征，核型正常，保留了正常二倍體的性質(zhì)；?具有無(wú)限增殖的能力；
?具有發(fā)育的多潛能性；
?具有種系傳遞功能；
?具有培養(yǎng)細(xì)胞所有的特征，可在體外培養(yǎng)、克隆、凍存及進(jìn)行遺傳操作。
24
材料
?PMSG（孕馬血清）、HCG（絨毛膜促性腺激素）、DMEM 培養(yǎng)液
?2+無(wú)CaPBS 緩沖液；磷酸鹽緩沖液（PBS 液）；0.125 %胰酶EDTA 混合液；絲裂酶素C2+、Mg
?胎牛血清、新生牛血清
?白血病抑制因子；干細(xì)胞生長(zhǎng)因子；牛胰島素
25
方法
1.
2.
3.
4.
5.胚胎的獲得與培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離干細(xì)胞集落的分離干細(xì)胞的鑒定統(tǒng)計(jì)分析
26
1. 胚胎的獲得與培養(yǎng)
?胚胎分別來(lái)自體成熟的自然發(fā)情或超數(shù)排卵的雌性昆明白小鼠，129 品系小鼠（6 周齡）。檢到陰道栓的早晨，記為015 dpc。分別于315 和4 dpc ，斷頸處死孕鼠，取出子宮，用含5%NBS的PBS 液從子宮角沖胚胎。
27
?在解剖鏡下，把沖洗后的胚胎轉(zhuǎn)移到鋪有飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板中，分別采用3 種不同培養(yǎng)液，即培養(yǎng)液1 : DMEM 液+ 10% NBS + 10% FCS培養(yǎng)液2 : 培養(yǎng)液1 + 1000 IU/ml IF
培養(yǎng)液3 : 培養(yǎng)液1 + 10 mg/ml 胰島素
37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察1 次，加、換液1 次，記錄有關(guān)胚胎貼壁、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass, ICM）出現(xiàn)等生長(zhǎng)情況。
28
2. 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離
?胚胎接種到有飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板中培養(yǎng)4～5 d 后，內(nèi)細(xì)胞群（ICM ）長(zhǎng)大，出現(xiàn)卵圓柱狀或島狀形態(tài)，周圍滋胚層細(xì)胞明顯展開(kāi)，此時(shí)應(yīng)分離ICM。
29全能細(xì)胞
30
?2+棄去原培養(yǎng)液，加入無(wú)Ca2+、Mg的PBS 液洗1 次。在解剖鏡下剝?nèi)CM 周圍的滋胚層細(xì)胞，用吸管把ICM 轉(zhuǎn)移到干凈的培養(yǎng)皿中。加一滴胰酶于ICM 上，37℃，消化3 min。
?將ICM 轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)液中，用吸管吹打?qū)⑵浯蛏ⅰ０汛蛏⒌募?xì)胞接種到有新鮮飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
31
3. 干細(xì)胞集落的分離
?分散的ICM 細(xì)胞培養(yǎng)3～7 d 后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
?此時(shí)形成的干細(xì)胞集落為F1 代，在解剖鏡下將F1 代干細(xì)胞集落挑出，按照ICM 分離法離F1代干細(xì)胞集落，再獲得的干細(xì)胞集落稱為F2 代，將F2 代干細(xì)胞集落挑出，再進(jìn)行分離傳代數(shù)次，直至獲得純凈的ES 細(xì)胞集落。
32
4. 干細(xì)胞的鑒定
?形態(tài)
?AKP （堿性磷酸酶）染色
33
34
(1) 形態(tài)鑒定：
典型的干細(xì)胞
?體積較小，有一個(gè)大核和少量的細(xì)胞質(zhì)。核中有一個(gè)或二個(gè)明顯的核仁黑色結(jié)構(gòu)。?細(xì)胞緊密成群，細(xì)胞界限不易區(qū)分。?在集落的邊緣區(qū)域可以看到清晰的單個(gè)細(xì)胞。
35
(2) AKP 染色鑒定：
?將待測(cè)細(xì)胞用含7.5%蔗糖的1%多聚甲醛固定，?底物buffer（100 M Tris-HCl pH9.5，50 mmol/l NaCl MgCl2，0.11% Tween-20）平衡，室溫避光染色：75 mg/ml nitroblue tetrazolium (NBT，硝基藍(lán)四氮唑) 溶于70% dimethyl-formamide (DMF) ，50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-in-dolyphophate toluidinium salt (BCIP) 溶于100%DMF ，染色前分別取45 μl 、35 μl 溶于10 ml 底物buffer 中，新鮮配制。ES ( PGC、EG) AKP 染色被染為深藍(lán)紫色，飼養(yǎng)層細(xì)胞、分化細(xì)
36胞不著色。
5. 統(tǒng)計(jì)分析
?SPSS
?Origin
37
誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（
Induced pluripotent stem cells, iPS cells
）
2007年11月20日，《細(xì)胞》和《科學(xué)》雜志幾乎同時(shí)發(fā)表了來(lái)自日本京都大學(xué)的山中伸彌（ShinyaYamanaka）團(tuán)隊(duì)和美國(guó)威斯康星大學(xué)的詹姆斯·湯姆森（JamesThomson）/俞君英團(tuán)隊(duì)，通過(guò)插入四個(gè)特定基因，第一次成功地將普普通通的人體38皮膚細(xì)胞，直接改造為功能與胚胎干細(xì)胞類似的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）
iPS干細(xì)胞建立的過(guò)程主要包括：
1.分離和培養(yǎng)宿主細(xì)胞
2.通過(guò)病毒介導(dǎo)或者其他的方式將若干多個(gè)多能性相關(guān)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞
3.將導(dǎo)入相關(guān)基因的細(xì)胞種植于飼養(yǎng)層細(xì)胞上，并于胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem cell，ES 細(xì)胞）專用培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，同時(shí)在培養(yǎng)中根據(jù)需要加入相應(yīng)的小分子物質(zhì)以促進(jìn)重編程
4.出現(xiàn)ES樣克隆后進(jìn)行iPS干細(xì)胞的鑒定（細(xì)胞形態(tài)、表觀遺傳學(xué)、體外分化潛能等方面）
39
iPS干細(xì)胞的應(yīng)用
?在基礎(chǔ)研究方面
它的出現(xiàn)，已經(jīng)讓人們對(duì)多能性的調(diào)控機(jī)制有了突破性的新認(rèn)識(shí)細(xì)胞重編程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，除了受細(xì)胞內(nèi)因子調(diào)控外，還受到細(xì)胞外信號(hào)通路的調(diào)控。對(duì)于Oct4、Sox2和Nanog等維持于細(xì)胞自我新能力的轉(zhuǎn)錄因子的研究正在逐漸地展開(kāi)；利用iPS干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，只操縱幾個(gè)因子的表達(dá)，這更會(huì)大大加速對(duì)多能性調(diào)控機(jī)理的深入研究。
?在實(shí)際應(yīng)用方面
iPS干細(xì)胞的獲得方法相對(duì)簡(jiǎn)單和穩(wěn)定，不需要使用卵細(xì)胞或者胚胎。這在技術(shù)上和倫理上都比其他方法更有優(yōu)勢(shì)，iPS干細(xì)胞的建立進(jìn)一步拉近了干細(xì)胞和臨床疾病治療的距離，iPS干細(xì)胞在細(xì)胞替代性治療以及發(fā)病機(jī)理的研究、新藥篩選方面具有巨大的潛在價(jià)值。此外，iPS干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈現(xiàn)，iPS干細(xì)胞在體外已成功地被分化為神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、心血管細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞等。在臨床40疾病治療中具有巨大應(yīng)用價(jià)值。
Kyoto team generates kidney tissue from iPS cells間介中胚層（intermediate
mesoderm，IM）是位于軸旁中胚層
和側(cè)中胚層之間的中胚層組織，可
分化為腎臟的主要器官，Osr1是IM
特異性的標(biāo)志蛋白。該研究首先通
過(guò)同源重組的方式，構(gòu)建Osr1-GFP
human induced pluripotent stem
cells (hiPSCs) 報(bào)告細(xì)胞。利用四
種方法誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化成IM細(xì)胞，
并通過(guò)Osr1-GFP進(jìn)行追蹤。從大鼠
胚胎內(nèi)取出的腎臟細(xì)胞與IM混合培
養(yǎng)，最終成長(zhǎng)為具有管狀結(jié)構(gòu)的組
織。該研究顯示，利用iPS細(xì)胞可以
誘導(dǎo)分化成立體的腎臟器官
1. Generation of OSR1-GFP knock-in hiPSC lines
?首先將含有OSR1的BAC載
體轉(zhuǎn)入E. coli 中
?之后將OSR1部分編碼區(qū)替
換成EGFP和PGK-Neo
cassettes，再用Cre重組酶
將PGK-Neo去除，完成基
因的敲入
?用選擇性培養(yǎng)基篩選已選
中的細(xì)胞。最后獲得OSR1-
GFP敲入的hiPSC細(xì)胞
42
2. Establishment of robust induction methods
of IM cells
43
?EB（embryoid body）method
a)
b)
c)當(dāng)hiPSC細(xì)胞濃度達(dá)到80%時(shí)（10-cm的培養(yǎng)皿），用PBS沖洗細(xì)胞，在DMEM中加入1 mg/ml膠原酶IV，培養(yǎng)細(xì)胞10min 。用PBS沖洗細(xì)胞，換成stage1培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)（DMEM/ F12 +Glutamax ，500 U/ml雙抗，2%FBS)將細(xì)胞接種到六孔板中，培養(yǎng)基為stage1，并添加100ng/ml 激活素A 和100ng/ml Wnt3a或1–3 mM CHIR99021。培養(yǎng)三天后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至明膠培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)20天。采用stage 2培養(yǎng)基（DMEM/F12 +Glutamax，0.1 mM 非必需氨基酸，500 U/ ml雙抗，0.55 mM 疏基乙醇，10% KSR，100 ng /ml，BMP7 (R&D Systems) ，100 ng Wnt3a 或1–3 mM CHIR99021）。
?Colony method
a)
b)將生長(zhǎng)在mouse embryonic ?broblasts (MEF) 培養(yǎng)層上hiPSC細(xì)胞分離出來(lái)（CKT溶液），在明膠培養(yǎng)皿中培養(yǎng)30min，去除MEFs，之后將細(xì)胞接種于人工基底膜培養(yǎng)皿中于ES培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%，按照EB method 的方法完成stage1，stage2的操作。
?Single-cell method
a)
b)hiPSC同樣生長(zhǎng)在MEF上，按照上述方法去除MEFs，用Accutase消化細(xì)胞使hiPSC形成單個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞種于Collagen Type I-coated 培養(yǎng)皿中，按照按照EB method 的方法完成stage1，stage2的操作，其中在stage1培養(yǎng)過(guò)程中額外加入10 mM Y27,632
?Serum-free-cell method
采用無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM/ F12 +Glutamax ，500 U/ml雙抗，1×B27，其他步驟同Single-cell method
44
3. Characterization of developmental potential of
human IM cell
?hiPSC分化的
于24孔板中，用stage2的培養(yǎng)基并添加10 mM Y27,632 和10 ng/ml TGFβ1培養(yǎng)7天。
?從ICE小鼠的第11.5天的胚胎中取出后腎組織，之后用0.05%胰酶-EDTA 37℃作用10 min，用腎培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)10min ，然后過(guò)濾。
?10×104后腎細(xì)胞與之前處理的1×104 OSR1(GFP)+細(xì)胞混合接種于96孔板中。加入10 mM Y27,632，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，形成聚合體。器官培養(yǎng)一周后，聚合體逐漸穩(wěn)固。
45+OSR1(GFP)細(xì)胞培養(yǎng)11天后，接種
利用病人尿液細(xì)胞獲得神經(jīng)干細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)染攜帶表達(dá)干細(xì)胞因子基因的載體的方式將一些干細(xì)胞因子導(dǎo)入從病人尿液中分離而來(lái)的細(xì)胞中并通過(guò)特殊的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，成功地將病人的尿液細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂泄δ艿纳窠?jīng)干細(xì)胞。這些由尿液細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來(lái)的神經(jīng)干細(xì)胞能夠在體外擴(kuò)增并在適當(dāng)?shù)臈l件下分化成熟為人體中各種存在的神經(jīng)元和角質(zhì)細(xì)胞。在進(jìn)一步的動(dòng)物模型的移植實(shí)驗(yàn)中，能夠很好的在46
Nature Methods 10: 84–89 (2013)
1. Isolation and culture ofHuman urine cells(HUCs)取中段尿500ml離心，獲得細(xì)胞，用尿液細(xì)胞培養(yǎng)基（1:1 DMEM/F12 培養(yǎng)基，10% FBS，0.1 mM 非必需氨基酸, 1 mM GlutaMAX，0.1 mM β-疏基乙醇）進(jìn)行培養(yǎng)。
2. Generation of integration-free
nPcs from human urine cells
a)包含OCT4，SOX2，KLF4 和SV40LT基因的
oriP/EBNA1-based pCEP4 載體與含有miR302–
367 precursor的pCEP4 載體共轉(zhuǎn)染到HUCs。
b)將共轉(zhuǎn)染后的HUCs接種到人工基底膜包被的6孔
板中，用尿液細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
c)第二天換成mTeSR 或5i培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q一次液，
15天之后，從5i中挑選克隆并于新的人工基底膜包
被的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。
d)將細(xì)胞分離成單個(gè)細(xì)胞并用神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)
行培養(yǎng)。
47
3. Neural differentiation in vitroa)pan-neuronal分化
hUiNPCs 單細(xì)胞接種到人工基底膜包被的培養(yǎng)皿中，用神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液N2B27并且加入EGF 和bFGF，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF，GDNF，CNTF，IGF1（10 ng/m)，1 ?M cAMP，細(xì)胞分化兩周后，通過(guò)檢測(cè)不同神經(jīng)細(xì)胞的不同標(biāo)記蛋白來(lái)檢測(cè)分化情況b) 樹(shù)突細(xì)胞的分化
hUiNPCs 種于poly-l-ornithine/laminin基底上，用DMEM/F12 培養(yǎng)基并添加1% N1，biotin (100 ng/ml)，PDGF-AA (20 ng/ml)，NT3 (20 ng/ml), 1 ?M cAMP and bFGF (10 ng/ml) 培養(yǎng)一周。之后三周的培養(yǎng)用IGF1替換bFGF 48
Tumor cell
49
腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)
50
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