不同組織的蛋白提取方法

不同組織的蛋白提取方法

一、植物組織蛋白質(zhì)提取方法

1、根據(jù)樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入），準(zhǔn)備提取液放在冰上。

2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時(shí)）。

3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

4、提取上清夜，樣品制備完成。

蛋白質(zhì)提取液：300ml

1、1Mtris-HCl（PH8）45ml

2、甘油（Glycerol）75ml

3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone6g

這種方法針對(duì)SDS-PAGE，垂直板電泳！

或者用三氯醋酸—丙酮沉淀法，離子濃度小的1、在液氮中研磨葉片

2、加入樣品體積3-204℃8000rpm以上13、的β-巰基乙醇），搖勻后離心（4℃8000rpm以上14、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心（15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)），可臨時(shí)保存在4℃待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆谩?/p>

藥品：

提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮

裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

二、組織：腸黏膜

應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟：

含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）

倒轉(zhuǎn)混勻，置室溫10min

離心：12000g，10min，4度，棄上清

加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）

振蕩，置室溫20min

離心：7500g，5min，4度，棄上清

重復(fù)0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次

沉淀中加入100％乙醇2ml

充分振蕩混勻，置室溫20min

離心：7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀

1％SDS溶解沉淀

離心：10000g，10min，4度

取上清-20度保存（或可直接用于BLOT存在的問題：加入1％SDS4度離心后又多了白色沉定，SDS左右。

2XBUFFER，然后煮5－10三、材料：細(xì)菌蛋白

2%的SDS，20mmol的2-巰基乙醇

四、腫瘤組織

0-4°C生理鹽水沖洗組織表面血跡，以1：9（即100ug重量加入900ul體積）的比例加入蛋白勻漿提取液，0-4°C冰水混合物中用1ml勻漿器制成10%的蛋白勻漿。勻漿在10000G離心10-15分鐘，取上清備用。

注：蛋白勻漿提取液(PH7.6)：Nacl50mMTris10mMEDTA1mM，PMSF1mM，Na3VO4.12H2O0.5mMNaF50mMBenzamidine1mM

五、腦組織

將切取的組織用4℃預(yù)冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血漬，再用濾紙吸干殘留的PBS，將組織稱重，將0.1G組織放入1ml的玻璃勻漿器，加入800l裂解液在冰

上充分勻漿，將得到的勻漿液用液氮反復(fù)凍融3次，室溫靜置30mins，4℃15000r/min離心1h，小心避開脂層，吸取上清，分裝，-80℃保存。

裂解液配方如下：

尿素7mol/l

硫脲2mol/l

CHAPS4%(m/v)

DTT65Mmol/L(上樣前臨加)

IPGBuffer0.5%(V/V)(上樣前臨加)

PMSF2ug/l(m/V)(上樣前臨加)

DNA酶12ug/l(m/V)(上樣前臨加)

RNA酶A2ug/l(m/V)(上樣前臨加)

六、細(xì)胞系蛋白提取

1.用槍吸棄培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，PBS避免細(xì)胞脫壁）

2.加1ml預(yù)冷的PBS3.4℃

上清得細(xì)胞沉淀

4.6孔板60ul/孔，培養(yǎng)瓶100ul/孔）重懸細(xì)30min（不定時(shí)輕彈EP管，使細(xì)胞混懸于裂解液中，從而使裂解充分，也可不彈）

5.4℃12000rpm20min離心，取上清于新EP管中4000rpm3min離心，棄

CellLysisBuffer

組分濃度：20mMTris-HClPH7.5

150mMNacl

1mMEDTA

0.5%NonidetP-40

1mM釩酸鈉

1mMPMSF

PIS（蛋白酶抑制劑）

配制方法

20mMTris-HClPH7.5

150mMNacl

1mMEDTA

調(diào)完P(guān)H后加0.5%NonidetP-40

裂解細(xì)胞時(shí)下列溶劑（全部溶解）以1:100比例加入裂解液中

100mM釩酸鈉（粉劑配成100mM后分裝于1.5mlEP管中-20度儲(chǔ)存）

100mMPMSF（粉劑配成100mM后分裝于1.5mlEP管中-20度儲(chǔ)存，避光）PIS（蛋白酶抑制劑）（-20度儲(chǔ)存）

七、酵母蛋白的提取方法

1準(zhǔn)備SD/-Leu或是YPD培養(yǎng)基20ml，酵母過夜培養(yǎng)，30℃，230rpm。2測(cè)OD600約1.0。

3100ml過夜培養(yǎng)物，1000g，離心，，44棄上清，重懸于80ul抽提buffer0.1MTris-Cl（PH7.5），0.2M，20％甘油，5mMEDTA，1mMPMSF。(100×)：PMSF，RT保存。

533ul（425-600um）。冰上操作，渦流10min6回收玻璃珠，并盡可能取上清到另一預(yù)冷的玻璃管中。

740ul的抽提buffer，同上渦流。

8離心后分離上清（回收玻璃珠）。

9液氮快速冷凍，-70℃儲(chǔ)存。

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