動物固體組織蛋白提取-Protocol
動物固體組織蛋白提取 Protocol
1、 前夜將磁珠及勻漿管洗凈置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和勻漿管，自然晾干；也
可放入烤箱中，速度較快。
2、 裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1，現(xiàn)配現(xiàn)用。（1000ulRIPA+10ulPMSF）。置入4℃冰
上。
3、抽蛋白（應(yīng)冰上進(jìn)行）：
a、適量組織（最好放入液氮中反復(fù)研磨成粉狀）加入裂解液中。一般10ml管體系中加入：7-8粒磁珠、100mg組織、1mlRIPA+10ulPMSF、1 tablet Cocktail。 b、勻漿。
手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次（6～8分鐘），充分研碎，使組織勻漿化。
機(jī)器勻漿：用組織搗碎機(jī)10000～15000r/min上下研磨制成10％組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備（勻漿時間10秒/次，間隙30秒，連續(xù)3～5次，在冰水中進(jìn)行），皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。
超聲粉碎：用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用40安培，5秒/次，間隙10秒反復(fù)3～5次。
反復(fù)凍融：培養(yǎng)或者分離的細(xì)胞可以用以上的方法勻漿，也可以反復(fù)凍溶3次左右（即讓細(xì)胞加適量的低滲液或者雙蒸水放低溫冰箱中結(jié)冰，溶解，再結(jié)冰，再溶解，反復(fù)3次左右），但有部分酶活力會受影響。 c、將組織勻漿轉(zhuǎn)入1.5ml的EP管中（eppendorf 管、離心管）。12000r/min 4°C 離心15min。 d、離心后EP管中液體分三層，提取中間無色液相，移入新的EP管中。可-80℃保存。 4、蛋白濃度測定。
a、配工作液：溶液A：溶液B=50：1（200ul：4ul）。
需測試復(fù)孔。標(biāo)本X，則需A量=2*（
X+1+1）*200；B=2*（X+1+1）*4。
c、復(fù)孔，取蛋白6ul加入0.6mlEP管，再加入54ulH2O，混勻。即10倍稀釋。
d、取20-25ul 10倍稀釋蛋白樣本加入96孔板平底板內(nèi)，再加入200ulAB工作液，混勻振蕩后，37℃ incubate 30min。
注：應(yīng)現(xiàn)加蛋白樣本，再加工作液。因為每次加蛋白后需換tip，再加入工作液即起反應(yīng)，應(yīng)縮短時間。
e、酶標(biāo)儀檢測562nm吸光度。Program f、計算蛋白濃度。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，如 Y=1.2745X-0.1684 其中Y：蛋白濃度；X：吸光度。 最終蛋白濃度為：10*Y（ug/ul、mg/ml） g、蛋白樣本放-80℃凍存。
大多數(shù)蛋白樣品可通過比色測定法定量。在典型的蛋白測定中，化學(xué)試劑加入到蛋白樣品溶液里產(chǎn)生顏色變化，這一變化可由分光光度計或酶標(biāo)儀檢測，并與已知濃度的蛋白標(biāo)
準(zhǔn)曲線作比較。博士德為大家提供兩種蛋白測定手段，每種都有其獨特的優(yōu)點。如果樣品數(shù)量較多，可以同時使用兩種測定用酶標(biāo)儀自動檢測。當(dāng)你選擇一種蛋白測定方法時需要考慮兩個因素：緩沖液的化學(xué)組成和檢測的蛋白量。
Commassie法（Bradford法）： 原理：在酸性條件，蛋白質(zhì)與考馬斯染料G-250結(jié)合，顏色從棕色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm處檢測吸光值然后與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計算出待測蛋白的濃度。
BCA法：
原理：在堿性條件下，蛋白將Cu++還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。
現(xiàn)對這兩種方法進(jìn)行比較： 一、實驗材料：
細(xì)胞總蛋白提取試劑盒（AR0103） M231
BCA蛋白定量試劑盒（AR0146）
Commassie改良增強型蛋白質(zhì)定量試劑盒（AR0145） 二、操作步驟： Commassie法： 1.將BSA凍干標(biāo)準(zhǔn)品（10mg/支）用生理鹽水或PBS稀釋成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八個濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2.M231用細(xì)胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。
3.各取20ul蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測M231樣品至相應(yīng)標(biāo)記的微孔板中。 4.滴加200ul考馬斯增強型試劑（溶液A）至每孔混勻并充分震蕩30S 5.停止震蕩，在室溫孵育樣品10min 6.在酶標(biāo)儀中測量595nm時的吸光值。
7.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷出樣品的蛋白濃度。 BCA法：
1.按50體積BCA試劑A加入1倍體積BCA試劑B配置適量BCA工作液，充分混勻。 2.將BSA凍干標(biāo)準(zhǔn)品（10mg/支）用生理鹽水或PBS稀釋成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八個濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.M231用細(xì)胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。
4.各取20ul蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測M231樣品至相應(yīng)標(biāo)記的微孔板中。 5.滴加200ulBCA工作液至每孔混勻并充分震蕩30S 6.停止震蕩，在37度孵育樣品30min 7.在酶標(biāo)儀中測量562nm時的吸光值。
8.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷出樣品的蛋白濃度。 三、實驗結(jié)果
其中1到8為2000ug/ml，1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625的標(biāo)準(zhǔn) 濃度的BSA蛋白，9為空白孔，樣品1為8倍稀釋M231總蛋白，樣品2為32倍稀釋M231總蛋白
Commassie法：
為了測試準(zhǔn)確，應(yīng)在試劑加入后的5～20min內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。 由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以算出樣品原始濃度為14.4mg/ml
Commassie法優(yōu)點是：
1.靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1ug。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。
2.測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。
3.干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
此法的缺點是：
1.由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的`偏差。
2. 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1M的NaOH。（如同0.1M的酸干擾Lowary法一樣）。
3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，在0-1000ug/ml濃度范圍內(nèi)有較好線性。因而不能用Beer定律進(jìn)行計算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。
BCA法：
由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以算出樣品原始濃度為14.28mg/ml BCA法特點： 1. 靈敏度高，檢測濃度下限達(dá)到25μg/ml，最小檢測蛋白量達(dá)到0.5μg，待測樣品體積為1-20μl 。 2. 測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達(dá)5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。 3. 在20-2000μg/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。 4. 檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。 5. 受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巰基乙醇低于1mM
BCA法和Commassie法各有優(yōu)勢，在不知道蛋白樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用，以消除定量的誤差。
（Radio Immunoprecipitation Assay）RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western、IP等。 RIPA使用方法
對于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：
1. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。
2. 對于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會被裂解。 對于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬細(xì)胞/管，然后再裂解。 裂解液用量說明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升。 對于組織樣品：
1. 把組織剪切成細(xì)小的碎片。
2. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。
3. 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)
4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
6. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
注：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正�，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組
DNA等的復(fù)合物。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NFκB、p53等時，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。 各種RIPA的差別及用途
蛋白酶及蛋白酶抑制劑大全 摘要：
破碎細(xì)胞提取蛋白質(zhì)的同時可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。以下列舉了5種常
用的蛋白酶抑制劑和他們各自的作用特點，因為各種蛋白酶對不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同，因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。
蛋白酶抑制劑
破碎細(xì)胞提取蛋白質(zhì)的同時可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。以下列舉了5種常用的蛋白酶抑制劑和他們各自的作用特點，因為各種蛋白酶對不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同，因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。由于蛋白酶抑制劑在液體中的溶解度極低，尤其應(yīng)注意在緩沖液中加人蛋白酶抑制劑時應(yīng)充分混勻以減少蛋白酶抑制劑的沉淀。在寶靈曼公司的目錄上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制劑表。
常用抑制劑
PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride（劇毒）
1)抑制絲氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巰基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);
2)10mg/ml溶于異丙醇中;
3)在室溫下可保存一年; 2-8℃可以存放數(shù)月之久。欲長期保存，可凍存在-20℃ 4)工作濃度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 儲存液濃度為100或200mM
5)在水液體溶液中不穩(wěn)定，必須在每一分離和純化步驟中加入新鮮的PMSF。 EDTA
1)抑制金屬蛋白水解酶;
2)0.5mol/L水溶液，pH8~9; 3)溶液在4℃穩(wěn)定六個月以上;
4)工作濃度:0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml);
5)加入NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值，否則EDTA不溶解。 胃蛋白酶抑制劑(pepstantin)
l)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管緊張肽原酶，組織蛋白酶D和凝乳酶; 2)1mg/ml溶于甲醇中;
3}儲存液在4℃一周內(nèi)穩(wěn)定，-20℃穩(wěn)定6個月; 4)1作濃度:0.7ug/ml(1umol/L) 5)在水中不溶解。
亮抑蛋白酶肽(leupeptin)
1)抑制絲氨酸和巰基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血漿酶和組織蛋白酶B; 2)lOmg/ml溶于水;
3)儲存液4℃穩(wěn)定一周，-20℃穩(wěn)定6個月; 4)工作濃度0.5mg/ml。 胰蛋白酶抑制劑(aprotinin)
1)抑制絲氨酸蛋白酶，如血漿酶，血管舒緩素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶; 2)lOmg/ml溶于水，pH7~8
3}儲存液4℃穩(wěn)定一周，-20℃穩(wěn)定6個月; 4)工作濃度:0.06~2.0ug/ml(0.01~0.3umol/L); 5)避免反復(fù)凍融:
6)在pH>12.8時失活。 蛋白酶抑制劑混合使用
35ug/ml PMSF…………………………………絲氨酸蛋白酶抑制劑 0.3mg/ml EDTA…………………………………金屬蛋白酶抑制劑
0.7ug/ml胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin)…………酸性蛋白酶抑制劑 0.5ug/ml亮抑蛋白肽酶(Leupeptin)……………廣譜蛋白酶抑制劑 常用蛋白酶抑制劑表
PMSF(Pheylmethylsulfonyl fluoride)是很常見的抑制劑，使用濃度為1 mmol/L。不可逆抑制絲氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。
AEBSF 絲氨酸抑制劑，使用濃度為4 mmol/L。AEBSF的抑制活性與PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低。因此是PMSF最佳的替代品，但價格較高。
磷酸酶抑制劑 NaF氟化鈉 溶解性：溶于水 分子量：41.99
使用：貯存液5M，工作濃度10~20mM。
Na3VO4 原礬酸鈉
分子量：183.91
溶解性：溶于水，我們購買過來的是原礬酸鈉。原礬酸鈉需要經(jīng)過處理以后才能成為激活的礬酸鈉，激活的礬酸鈉才具有抑制去磷酸化的作用。
原因：原釩酸鈉有一定程度的聚合，使用前要激活使之變成單體才有最大抑制效價 原礬酸鈉變成激活的礬酸鈉的過程是：100mM 原礬酸鈉激活儲存液配制
(1). 取0.183克的原礬酸鈉溶解于10ml的雙蒸水中，加酸調(diào)節(jié)PH至10(顏色變黃)。 (2). 煮至無色 (3). 室溫冷卻 (4). 重調(diào)pH至10
(5). 重復(fù)(1)(2)(3)(4)直至溶液保持無色，并且pH穩(wěn)定于10，分裝100ul/管，每10ml裂解液加一管。
使用：貯存液100mM， 工作濃度1mM，-20度保存。
Beta-glycerophosphate 甘油磷酸鈉 溶解性：溶于水 分子量：306.11
使用：貯存液100mM， 工作濃度25mM。
Na2P2O4 焦磷酸鈉 溶解性：溶于水 分子量：265.9
使用：貯存液100mM，工作濃度1-2 mM。
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